海洋所成功實現(xiàn)微生物代謝過程的原位拉曼可視化定量分析
中科院海洋所張鑫課題組和孫超岷課題組共同合作,基于共聚焦顯微拉曼技術(shù),通過三維定量成像實現(xiàn)了長期、近實時、非破壞性的微生物監(jiān)測,對微生物生長和代謝情況進行可視化及定量分析,為未來分析微生物原位生物過程提供了新思路。研究成果近日發(fā)表于國際學(xué)術(shù)期刊《微生物學(xué)譜》(Microbiology Spectrum,IF= 9.043)上。
張鑫課題組在之前的工作中,觀測到我國南海冷泉環(huán)境中單質(zhì)硫含量豐富。隨后孫超岷課題組發(fā)現(xiàn)了冷泉細菌Erythrobacter flavus 21-3可以高效氧化硫代硫酸鈉生成單質(zhì)硫,張鑫課題組通過拉曼光譜鑒定后發(fā)現(xiàn)單質(zhì)硫結(jié)構(gòu)為環(huán)狀S8,研究成果發(fā)表在生物學(xué)領(lǐng)域權(quán)威期刊《國際微生物生態(tài)學(xué)會雜志》(The ISME Journal)。后續(xù)兩個課題組合作將E. flavus 21-3及其突變株布放到深海冷泉噴口附近進行原位培養(yǎng),證實該菌株在深海原位環(huán)境中也能形成硫單質(zhì),相關(guān)成果發(fā)表在國際生物學(xué)期刊《微生物學(xué)》(mBio),為解釋我國南海冷泉噴口廣泛分布硫單質(zhì)的成因提供了重要理論依據(jù)。
由此可見,微生物是深海硫形成和循環(huán)的重要貢獻者,其介導(dǎo)的硫代謝的研究對于了解深海硫循環(huán)至關(guān)重要。然而,由于深海環(huán)境極端復(fù)雜,采樣困難、微生物難于分離培養(yǎng)等因素,以及缺少對硫元素的形成的近實時無損的監(jiān)測方法,深海微生物的原位探測面臨巨大挑戰(zhàn)。目前主要通過經(jīng)典的生物和化學(xué)方法研究硫元素的生成過程,例如X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)、高效液相色譜、透射電子顯微鏡、離子色譜法或化學(xué)計量法等。但是這些方法主要通過取樣來獲知特定時間點的微生物代謝情況,不能在不破壞樣品的前提下連續(xù)監(jiān)測其在時間尺度上的代謝過程;并且其中一些方法樣品制備復(fù)雜,會破壞細胞的原位真實性;也可能會出現(xiàn)取樣不均勻及污染的情況,導(dǎo)致難以實現(xiàn)連續(xù)的原位觀察。因此,亟需新的方法突破此瓶頸。
共聚焦顯微拉曼三維成像技術(shù)擁有低成本、快速、無標簽和無破壞性的優(yōu)勢,具有將定性、定量和可視化完美結(jié)合的潛力,為我們解決相關(guān)問題提供了新的思路。因此,為證明此技術(shù)的潛力,研究團隊構(gòu)建了一套固態(tài)基底上微生物群落拉曼三維定量原位分析方法,將光學(xué)可視化與拉曼定量分析相結(jié)合,可在時間和空間兩個維度上無損定量表征微生物群落代謝過程。該技術(shù)已成功應(yīng)用到深海冷泉細菌E. flavus 21-3硫代謝過程的原位監(jiān)測?;诶S成像進行體積計算和比率分析,對不同環(huán)境下的菌落生長和代謝進行了量化,發(fā)現(xiàn)了生長和代謝方面不為人知的細節(jié),為厘清深海冷泉生物群落中廣泛分布的硫單質(zhì)成因提供了重要技術(shù)支持。據(jù)我們所知,這是首次嘗試長期監(jiān)測菌落在固體培養(yǎng)基中生長的原位無損技術(shù)。我們能夠快速確定代謝產(chǎn)物,推斷反應(yīng)發(fā)生的途徑,并快速篩選產(chǎn)硫細菌。由于這一成果的應(yīng)用,不僅證明了該方法在未來對微生物原位過程的可視化及定量分析的潛力,也為研究深海中附著在巖石沉積物等固體表面上的微生物提供了新的思路。
圖1 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落的三維定量成像示意圖

圖2 E. flavus 21-3在高氧條件下的三維拉曼成像分析
(A) E. flavus 21-3的三維拉曼成像,其中黃色代表S8,綠色代表類胡蘿卜素。(B) E. flavus 21-3的拉曼光譜:黑色代表生成的S8,綠色代表生成的類胡蘿卜素。(C) 在高氧條件下生長的E. flavus 21-3的類胡蘿卜素的累積量和變化率。(D) 在高氧條件下生長的E. flavus 21-3的S8的累積量和變化率
圖3 低氧條件下E. flavus 21-3的三維拉曼成像分析
(A) E. flavus 21-3的三維拉曼成像,其中黃色代表S8,綠色代表類胡蘿卜素。(B) 低氧條件下E. flavus 21-3中類胡蘿卜素的累積量和變化率。(C) 低氧條件下E. flavus 21-3中S8的累積量和變化率

圖4 不同含氧量條件下E. flavus 21-3中與硫轉(zhuǎn)化有關(guān)的代謝產(chǎn)物的拉曼特征峰面積比值分析
(A)高氧條件,(B)低氧條件
中科院海洋所博士研究生何婉瑩、蔡瑞寧為文章共同第一作者,研究員張鑫、孫超岷為文章通訊作者,正高級工程師欒振東、副研究員杜增豐、博士席世川、碩士研究生殷子鈺為文章共同作者。研究得到了國家自然科學(xué)基金、中國科學(xué)院A類戰(zhàn)略性先導(dǎo)專項、中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心重點部署項目、泰山青年學(xué)者計劃等項目聯(lián)合資助,以及WITec公司吳望華博士和胡海龍博士的支持。
相關(guān)成果如下:
Wanying He; Ruining Cai; Shichuan Xi; Ziyu Yin; Zengfeng Du; Zhendong Luan; Chaomin Sun*, Xin Zhang*. Study of microbial sulfur metabolism in a near real-time pathway through confocal Raman quantitative 3D imaging[J]. Microbiology Spectrum, 2023, IF= 9.043.
論文DOI: 10.1128/spectrum.03678-22
Jing Zhang; Rui Liu; Shichuan Xi; Ruining Cai; Xin Zhang, Chaomin Sun*. A novel bacterial thiosulfate oxidation pathway provides a new clue about the formation of zero-valent sulfur in deep sea[J]. The ISME Journal, 2020,14(9):2261-2274.
論文DOI: 10.1038/s41396-020-0684-5
Ruining Cai; Wanying He; Rui Liu; Jing Zhang; Xin Zhang, Chaomin Sun*. Deep-sea in situ insights into the formation of zero-valent sulfur driven by a bacterial thiosulfate oxidation pathway[J]. mBio, 2022,13(4):e14322.
論文DOI: 10.1128/mbio.00143-22
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