海水魚類條石鯛性別特異性標(biāo)記高效開發(fā)取得突破性進(jìn)展
近日,國(guó)際綜合性Top期刊GigaScience(JCR 1區(qū),IF=11.8)以Research Article形式在線刊發(fā)了海洋所李軍研究團(tuán)隊(duì)與劉靜研究團(tuán)隊(duì)合作完成的最新研究成果,該成果創(chuàng)新性建立了一種魚類低成本、高通量、易檢測(cè)的大片段結(jié)構(gòu)變異(SVs>100bp)性別特異性標(biāo)記開發(fā)技術(shù),解決了魚類性別鑒定標(biāo)記少、鑒定效率低、現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用難的問題,為助力魚類性別決定機(jī)制深入研究和性控育種提供了重要技術(shù)手段,同時(shí)也為其他養(yǎng)殖生物類群性別特異性標(biāo)記精準(zhǔn)開發(fā)提供了借鑒。

魚類性別特異性標(biāo)記技術(shù)開發(fā)歷程
魚類性別特異性標(biāo)記的開發(fā)始于20世紀(jì)90年代,分為三個(gè)主要時(shí)期:性別標(biāo)記探索期(1991~2006)、性別標(biāo)記篩選突破期(2007~2012)和性別標(biāo)記篩選快速發(fā)展期(2013~2023)。前兩個(gè)時(shí)期性別鑒定采用的方法主要是DNA指紋圖譜識(shí)別技術(shù),如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等,這些技術(shù)存在性別鑒定標(biāo)記少、實(shí)驗(yàn)操作過程復(fù)雜、鑒定效率不穩(wěn)定等問題。自2012年來以Illumina為代表的二代高通量測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展(如PE150),使得魚類性別標(biāo)記篩選進(jìn)入到了SNP/InDel級(jí)別,精準(zhǔn)度明顯提高,但投入成本高昂、現(xiàn)場(chǎng)性別鑒定操作難以實(shí)現(xiàn)等問題,制約了魚類性別控制育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展進(jìn)程。目前,隨著以PacBio為代表三代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,特別是Revio系統(tǒng)的推出,其長(zhǎng)讀長(zhǎng)(10kb~20kb)測(cè)序技術(shù)使得基于大片段結(jié)構(gòu)變異(SVs>100bp)的性別特異性標(biāo)記高通量精準(zhǔn)開發(fā)成為可能,這標(biāo)志著魚類性別特異性標(biāo)記開發(fā)進(jìn)入了一個(gè)新時(shí)代,將大大推動(dòng)魚類性別控制育種產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

條石鯛性別特異性標(biāo)記高效開發(fā)示意圖
條石鯛隸屬于石鯛科石鯛屬,為我國(guó)網(wǎng)箱、工廠化養(yǎng)殖以及海洋牧場(chǎng)增殖重要新對(duì)象。團(tuán)隊(duì)通過前期研究發(fā)現(xiàn)條石鯛類性狀典型:具“鳥喙?fàn)睢庇淆X;雌雄生長(zhǎng)二態(tài)性;雄魚(2n=47)染色體較雌魚(2n=48)少一條,且雄魚染色體中存在一條體型異常巨大的染色體(X1X1X2X2/X1X2Y)。肖永雙副研究員于2019年和2020年在國(guó)際上率先系統(tǒng)揭示條石鯛雄魚異型染色體融合起源機(jī)理(成果發(fā)表在iScience,GigaScience)基礎(chǔ)上,針對(duì)具生長(zhǎng)二態(tài)性X1X2Y系統(tǒng)魚類雄性單性育種的需求,基于已發(fā)表的條石鯛雌、雄線性基因組信息采用全基因組變異位點(diǎn)高效掃描和雙向比對(duì)的策略,生成雌雄基因組間大片段結(jié)構(gòu)變異(>100 bp)DNA插入/缺失變異數(shù)據(jù)庫(kù),測(cè)算插入/缺失位點(diǎn)CLR數(shù)據(jù)深度并對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)排序,運(yùn)用目標(biāo)標(biāo)記區(qū)域引物高通量設(shè)計(jì)技術(shù)和電子PCR(e-PCR)技術(shù)對(duì)候選標(biāo)記進(jìn)行高通量數(shù)字模擬擴(kuò)增和篩選,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證,構(gòu)建了條石鯛雌、雄遺傳性別鑒定的高通量精準(zhǔn)標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)。研究團(tuán)隊(duì)基于上述技術(shù)開發(fā)流程,分別獲得3645(2852 INS/874 DEL SVs)和3872個(gè)(3077 INS/833 DEL SVs)雌雄性別特異性標(biāo)記,以及1021個(gè)(12.50,以♂為參考)和894個(gè)(5.48,以♀為參考)高置信的遺傳性別鑒定標(biāo)記。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),高比例的缺失序列標(biāo)簽變異位點(diǎn)主要定位在轉(zhuǎn)座因子區(qū)域(78.44%)和串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)域(33.67%),研究為魚類染色體大型結(jié)構(gòu)變異的插入-缺失事件發(fā)生模式提供新的見解。

條石鯛雌雄大片段結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)挖掘、識(shí)別、分類及高置信標(biāo)記錨定

條石鯛性別特異性標(biāo)記位點(diǎn)e-PCR檢驗(yàn)以及瓊脂糖凝膠驗(yàn)證
研究團(tuán)隊(duì)基于長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)(~10kb)開發(fā)的條石鯛性別特異性標(biāo)記的新技術(shù)流程,與第一代和第二代性別鑒定技術(shù)相比,該方法能夠獲得更多的大型結(jié)構(gòu)變異(>100bp)性別特異性標(biāo)記,顯著提高了擴(kuò)增和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)識(shí)別效率,同時(shí)降低了性別鑒定檢測(cè)成本,成果成功應(yīng)用于條石鯛、斑石鯛雌、雄以及縞蝦虎魚屬種質(zhì)鑒定,獲得授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利13項(xiàng)。同時(shí),該技術(shù)可以與PacBio和ONT等長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)無縫銜接。此外,該方法可適用于多種性別決定系統(tǒng),尤其適合具有異形染色體的系統(tǒng)(如XY、ZW、XX/XY1Y2、ZZ/ZW1W2)及其他性別決定機(jī)制的物種。這一創(chuàng)新成果將為海水魚類性控育種提供強(qiáng)大技術(shù)支持,推動(dòng)海水魚類育種相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。
中國(guó)科學(xué)院海洋研究所為文章第一完成單位,肖永雙副研究員和肖志忠研究員為論文第一作者,李軍研究員和劉靜研究員為文章共同通訊作者。該研究得到了國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心重點(diǎn)部署項(xiàng)目(前沿交叉類)等項(xiàng)目聯(lián)合資助。
文章目錄:
1、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Lin Liu#, Yuting Ma, Haixia Zhao, Yanduo Wu, Jinwei Huang, Pingrui Xu, Jing Liu*, Jun Li*. Innovative approach for high-throughput exploiting sex-specific markers in Japanese parrotfish Oplegnathus fasciatus. GigaScience. 2024, giae045, 13: 1-16. https://doi.org/10.1093/gigascience/giae045
2、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Daoyuan Ma, Jing Liu*, Jun Li*. Genome sequence of the barred knifejaw Oplegnathus fasciatus (Temminck & Schlegel, 1844): the first chromosome-level draft genome in the family Oplegnathidae. GigaScience, 2019, giz013, 1-8. https://doi.org/10.1093/gigascience/giz013
3、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Daoyuan Ma, Chenxi Zhao, Lin Liu, Hao Wu, Wenchao Nie, Shijun Xiao*, Jing Liu* and Jun Li*, Angel Herrera-Ulloa. Chromosome-level Genome Reveals the Origin of Neo-Y Chromosome in the Male Barred knifejaw Oplegnathus fasciatus. iScience,2020. 23, 101039. (Cell子刊)
授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利目錄:
1. 肖永雙,趙海霞,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2024/5/28,專利號(hào)ZL 2024 1 0257085.5。
2. 肖永雙,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2024/3/11,專利號(hào)ZL 2024 1 0269995.5。
3. 肖永雙,馬玉婷,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/3/12,專利號(hào)ZL 2024 1 0275540.4。
4. 肖永雙,吳燕鐸,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2024/5/31,專利號(hào):ZL 2024 1 0275541.9。
5. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/18,專利號(hào):ZL 2024 1 0330538.2。
6. 肖永雙,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2024/6/4,專利號(hào):ZL 2024 1 0338304.2。
7. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/14,專利號(hào):ZL 2024 1 0346897.7。
8. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/11,專利號(hào):ZL 2024 1 0354461.2。
9. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/7,專利號(hào):ZL 2024 1 0354464.6。
10. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/18,專利號(hào):ZL 2024 1 0355231.8。
11. 肖永雙,陳少華,韋杰鴻,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/3/1,專利號(hào):ZL 2023 1 1733365.0。
12. 肖永雙,吳燕鐸,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2022/5/6,專利號(hào):ZL 2022 1 0083551.3。
13. 肖永雙,馬玉婷,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2022/5/6,專利號(hào):ZL 2022 1 0088031.1。
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