海水魚類條石鯛性別特異性標記高效開發(fā)取得突破性進展
近日,國際綜合性Top期刊GigaScience(JCR 1區(qū),IF=11.8)以Research Article形式在線刊發(fā)了海洋所李軍研究團隊與劉靜研究團隊合作完成的最新研究成果,該成果創(chuàng)新性建立了一種魚類低成本、高通量、易檢測的大片段結(jié)構(gòu)變異(SVs>100bp)性別特異性標記開發(fā)技術(shù),解決了魚類性別鑒定標記少、鑒定效率低、現(xiàn)場應(yīng)用難的問題,為助力魚類性別決定機制深入研究和性控育種提供了重要技術(shù)手段,同時也為其他養(yǎng)殖生物類群性別特異性標記精準開發(fā)提供了借鑒。

魚類性別特異性標記技術(shù)開發(fā)歷程
魚類性別特異性標記的開發(fā)始于20世紀90年代,分為三個主要時期:性別標記探索期(1991~2006)、性別標記篩選突破期(2007~2012)和性別標記篩選快速發(fā)展期(2013~2023)。前兩個時期性別鑒定采用的方法主要是DNA指紋圖譜識別技術(shù),如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等,這些技術(shù)存在性別鑒定標記少、實驗操作過程復(fù)雜、鑒定效率不穩(wěn)定等問題。自2012年來以Illumina為代表的二代高通量測序技術(shù)快速發(fā)展(如PE150),使得魚類性別標記篩選進入到了SNP/InDel級別,精準度明顯提高,但投入成本高昂、現(xiàn)場性別鑒定操作難以實現(xiàn)等問題,制約了魚類性別控制育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展進程。目前,隨著以PacBio為代表三代高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展,特別是Revio系統(tǒng)的推出,其長讀長(10kb~20kb)測序技術(shù)使得基于大片段結(jié)構(gòu)變異(SVs>100bp)的性別特異性標記高通量精準開發(fā)成為可能,這標志著魚類性別特異性標記開發(fā)進入了一個新時代,將大大推動魚類性別控制育種產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

條石鯛性別特異性標記高效開發(fā)示意圖
條石鯛隸屬于石鯛科石鯛屬,為我國網(wǎng)箱、工廠化養(yǎng)殖以及海洋牧場增殖重要新對象。團隊通過前期研究發(fā)現(xiàn)條石鯛類性狀典型:具“鳥喙狀”愈合齒;雌雄生長二態(tài)性;雄魚(2n=47)染色體較雌魚(2n=48)少一條,且雄魚染色體中存在一條體型異常巨大的染色體(X1X1X2X2/X1X2Y)。肖永雙副研究員于2019年和2020年在國際上率先系統(tǒng)揭示條石鯛雄魚異型染色體融合起源機理(成果發(fā)表在iScience,GigaScience)基礎(chǔ)上,針對具生長二態(tài)性X1X2Y系統(tǒng)魚類雄性單性育種的需求,基于已發(fā)表的條石鯛雌、雄線性基因組信息采用全基因組變異位點高效掃描和雙向比對的策略,生成雌雄基因組間大片段結(jié)構(gòu)變異(>100 bp)DNA插入/缺失變異數(shù)據(jù)庫,測算插入/缺失位點CLR數(shù)據(jù)深度并對標記位點排序,運用目標標記區(qū)域引物高通量設(shè)計技術(shù)和電子PCR(e-PCR)技術(shù)對候選標記進行高通量數(shù)字模擬擴增和篩選,通過瓊脂糖凝膠電泳進行現(xiàn)場驗證,構(gòu)建了條石鯛雌、雄遺傳性別鑒定的高通量精準標記數(shù)據(jù)庫。研究團隊基于上述技術(shù)開發(fā)流程,分別獲得3645(2852 INS/874 DEL SVs)和3872個(3077 INS/833 DEL SVs)雌雄性別特異性標記,以及1021個(12.50,以♂為參考)和894個(5.48,以♀為參考)高置信的遺傳性別鑒定標記。研究進一步發(fā)現(xiàn),高比例的缺失序列標簽變異位點主要定位在轉(zhuǎn)座因子區(qū)域(78.44%)和串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)域(33.67%),研究為魚類染色體大型結(jié)構(gòu)變異的插入-缺失事件發(fā)生模式提供新的見解。

條石鯛雌雄大片段結(jié)構(gòu)變異位點挖掘、識別、分類及高置信標記錨定

條石鯛性別特異性標記位點e-PCR檢驗以及瓊脂糖凝膠驗證
研究團隊基于長讀長測序技術(shù)(~10kb)開發(fā)的條石鯛性別特異性標記的新技術(shù)流程,與第一代和第二代性別鑒定技術(shù)相比,該方法能夠獲得更多的大型結(jié)構(gòu)變異(>100bp)性別特異性標記,顯著提高了擴增和現(xiàn)場檢測識別效率,同時降低了性別鑒定檢測成本,成果成功應(yīng)用于條石鯛、斑石鯛雌、雄以及縞蝦虎魚屬種質(zhì)鑒定,獲得授權(quán)國家發(fā)明專利13項。同時,該技術(shù)可以與PacBio和ONT等長讀長數(shù)據(jù)無縫銜接。此外,該方法可適用于多種性別決定系統(tǒng),尤其適合具有異形染色體的系統(tǒng)(如XY、ZW、XX/XY1Y2、ZZ/ZW1W2)及其他性別決定機制的物種。這一創(chuàng)新成果將為海水魚類性控育種提供強大技術(shù)支持,推動海水魚類育種相關(guān)產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。
中國科學(xué)院海洋研究所為文章第一完成單位,肖永雙副研究員和肖志忠研究員為論文第一作者,李軍研究員和劉靜研究員為文章共同通訊作者。該研究得到了國家自然基金面上項目、國家重點研發(fā)計劃、中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心重點部署項目(前沿交叉類)等項目聯(lián)合資助。
文章目錄:
1、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Lin Liu#, Yuting Ma, Haixia Zhao, Yanduo Wu, Jinwei Huang, Pingrui Xu, Jing Liu*, Jun Li*. Innovative approach for high-throughput exploiting sex-specific markers in Japanese parrotfish Oplegnathus fasciatus. GigaScience. 2024, giae045, 13: 1-16. https://doi.org/10.1093/gigascience/giae045
2、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Daoyuan Ma, Jing Liu*, Jun Li*. Genome sequence of the barred knifejaw Oplegnathus fasciatus (Temminck & Schlegel, 1844): the first chromosome-level draft genome in the family Oplegnathidae. GigaScience, 2019, giz013, 1-8. https://doi.org/10.1093/gigascience/giz013
3、Yongshuang Xiao#, Zhizhong Xiao#, Daoyuan Ma, Chenxi Zhao, Lin Liu, Hao Wu, Wenchao Nie, Shijun Xiao*, Jing Liu* and Jun Li*, Angel Herrera-Ulloa. Chromosome-level Genome Reveals the Origin of Neo-Y Chromosome in the Male Barred knifejaw Oplegnathus fasciatus. iScience,2020. 23, 101039. (Cell子刊)
授權(quán)國家發(fā)明專利目錄:
1. 肖永雙,趙海霞,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2024/5/28,專利號ZL 2024 1 0257085.5。
2. 肖永雙,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2024/3/11,專利號ZL 2024 1 0269995.5。
3. 肖永雙,馬玉婷,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/3/12,專利號ZL 2024 1 0275540.4。
4. 肖永雙,吳燕鐸,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2024/5/31,專利號:ZL 2024 1 0275541.9。
5. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/18,專利號:ZL 2024 1 0330538.2。
6. 肖永雙,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2024/6/4,專利號:ZL 2024 1 0338304.2。
7. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/14,專利號:ZL 2024 1 0346897.7。
8. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/11,專利號:ZL 2024 1 0354461.2。
9. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/7,專利號:ZL 2024 1 0354464.6。
10. 肖永雙,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/6/18,專利號:ZL 2024 1 0355231.8。
11. 肖永雙,陳少華,韋杰鴻,肖志忠,李軍等。授權(quán)日期2024/3/1,專利號:ZL 2023 1 1733365.0。
12. 肖永雙,吳燕鐸,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2022/5/6,專利號:ZL 2022 1 0083551.3。
13. 肖永雙,馬玉婷,李軍,肖志忠等。授權(quán)日期2022/5/6,專利號:ZL 2022 1 0088031.1。
文章鏈接:
https://doi.org/10.1093/gigascience/giae045
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